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              北京智鼠多寶生物科技有限責任公司
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              小鼠腦立體定位技術相關實驗一般流程

              腦立體定位技術可以說是目前神經科學研究中不可缺少的一個*基礎的技術手段。我甚至找不到一個做神經科學研究的實驗室可以不使用這種技術的。


              我在碩士階段使用腦立體定位技術進行過病毒注射、電極陣列埋置、導藥管埋置光纖埋置等實驗。后來了解過微型攝像頭埋置,現在讀博士了還了解到有透析探針埋置等……


              我總結了一下,腦立體定位的目的大概有下面這么3種:

              1. 注射:把什么東西注射到腦組織里面去;

              2. 取材:從腦組織里取什么東西出來;

              3. 記錄:通過向顱內埋置細微裝置記錄腦內各種光學或電學信號。


              這是我目前接觸到以及了解到的與腦立體定位技術相關的3種類型的實驗。


              可以看出它們的本質其實都是腦立體定位技術。它們的一般流程包括:

              (1)確定坐標:根據腦圖譜確定目標腦區的三維坐標;

              (2)顱骨鉆孔:經過顱骨平面調平后將目標坐標在X-Y軸平面上的顱骨上鉆孔;

              (3)定位植入:然后根據不同的實驗目的將注射電極、導管、探針、光纖、攝像頭等植入目標腦區。


              我們可以看出這些實驗的基本步驟都是一樣的,唯壹不同的只是*后一步植入的物件不同罷了。因此今天這篇分享采用更常見的病毒注射實驗來舉例。



              1.根據腦圖譜確定定位坐標


              腦圖譜我提供兩個網站(當然,網上也可以很輕松的下載到大小鼠的腦圖譜):

              大鼠腦立體定位圖譜:

              http://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas/

              小鼠腦立體定位圖譜:

              http://labs.gaidi.ca/mouse-brain-atlas/



              2.玻璃微電極制作與裝配

              (1)制作

              這一步只有病毒注射這樣的實驗需要,其他實驗是不需要的。不同的病毒注射工具對注射的準確度以及對小鼠腦組織的損傷程度差異還是很大的,我碩士階段一直使用的就是下圖這種所謂的“微量注射器”。


              這種工具因為對腦組織損傷很大,現在已經很少用到了。這里單獨介紹應用更廣泛的“玻璃微電極”的制作。


              它是使用下面這種微玻璃管通過電極拉制儀拉制而成


              拉制的時候,先調好拉制儀的參數


              裝好玻璃電極并關上蓋子拉制電極


              拉制完成后,根據實際需要用顯微剪將電極**剪掉一部分,這樣就得到了兩根玻璃微電極。


              我們實驗室一個老師自制了一臺高速旋轉磨盤,可以將電極**磨成一個45~60°的楔面,這樣可以更利于電極插入腦組織,不易斷針。


              局部放大圖如下


              在專門的顯微鏡下可以觀察微電極針尖細節


              每次可以多拉一些,放在一個培養皿中,用橡皮泥固定備用


              (2)裝配

              玻璃微電極裝在微量注射泵之前先用1ml的注射器吸取礦物油填充玻璃微電極(否則后面吸入病毒時,玻璃微電極尾端會有空氣,在注射的時候空氣被壓縮,導致病毒注射的量誤差嚴重)。


              礦物油填滿后將玻璃微電極尾端接在注射泵針頭上即可






              3.手術

              (1)麻醉

              這個在不同的實驗室可能使用不同的***,就不多列舉了。我只說我認為*好的麻醉方式——異氟烷霧化吸入麻醉。




              整套系統如下

              ▲左圖為麻醉機主體部分和透明的預麻箱;中間圖為抽氣泵和吸收罐;右圖為制氧機


              麻醉機打開之后,將小鼠先放入預麻箱,然后向預麻箱中丟入一根浸有異氟烷的棉簽,不到1min小鼠就進入麻醉狀態。


              預麻完成之后將小鼠固定在定位器適配器上,適配器的鼻夾其實就是一個連接在麻醉機上的麻醉面罩

              這樣小鼠后續實驗過程中就可以一直吸入麻醉,并可以根據小鼠手術過程中的呼吸狀態實時調整麻藥濃度和供氧速率等。


              比如當小鼠呼吸慢而深的時候,提示麻醉太深,需要減小麻藥濃度,增大供氧;而當手術過程中小鼠會因為感到疼痛而擺動的時候,說明麻醉強度不夠,就需要增加麻藥濃度;理想的麻醉狀態是小鼠呼吸均勻、快而淺。


              (2)頭部固定

              小鼠預麻醉完成之后,將小鼠固定在定位器的適配器上:在彎鑷的輔助下將牙齒插入牙槽  順次將左右側耳釘從耳洞進入插在下頜骨下方托住頭顱 → 固定耳釘 → 固定鼻夾(麻醉面罩)。



              這個部分,我的經驗是先將兩側耳釘在中間對齊,然后對稱的后退約1~2mm,使得兩根耳釘**間隔2~4mm。這個時候將左側的耳釘固定下來,然后再將小鼠托在手上,將加熱板調低,用手托著將小鼠牙齒卡入牙槽,緊接著用鑷子夾住小鼠的左耳使耳釘進入耳洞,用左手微微向上托起小鼠身體;再將右側耳釘插入耳洞,托起身體,調整右側耳釘的刻度與左側相同,同時觀察小鼠呼吸狀態良好,小鼠顱骨處于耳釘上方,說明耳釘插入正確。*后將鼻夾(麻醉面罩)套在口鼻上固定,將加熱板上調至適當位置。


              (3)顱骨平面調平

              頭部固定好后,用眼藥膏涂蓋小鼠雙眼,防止照明燈長時間照射傷害小鼠眼睛,用眼科剪剪掉(或用剃刀剃掉)小鼠頭頂毛發,剪開頭皮,用棉簽擦掉顱骨表面組織,充分暴露出Bregma點。


              裝配上微量注射泵,在顯微鏡下找到Bregma點,設為立體坐標原點


              調平時,按照前后Bregma點和Lambda點調平;左(AP 0, ML -2.0)和右(AP 0, ML +2.0)點調平。調平兩側的誤差不超過0.05mm。


              (4)顱骨鉆孔與定位注射

              顱骨調平后,再次將玻璃微電極調回原點,根據目標腦區坐標的AP和ML值,確定在顱骨平面的投影區域進行鉆孔。鉆孔結束后使用1ml的注射器**(提前將**向楔面后彎折)小心挑破腦膜。


              再次回到原點,重新定位微電極到目標核團在顱骨表面的投影區,然后根據DV值將微電極插入腦組織內目標區域。


              Tips:

              1.電極:拉制完成后不要剪得太短,因為有經驗的同學都知道,**越長越細反而更柔軟、更不容易斷;

              2.麻醉:建議采用異氟烷麻醉,使用麻醉機和制氧機;

              3.坐標:根據圖譜查出來的坐標建議先使用臺盼藍這樣的染料在廢鼠上進行預實驗,不斷調整定位的坐標;

              4.手術:暴露Bregma點的時候不要使用雙氧水,實際上我不建議這個實驗的任何地方使用雙氧水,因為雙氧水可能殘留在顱骨上導致后期顱骨腐蝕,對于需要二次手術的實驗來說,就是災難。

              京公網安備 11011502003119號

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