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              北京智鼠多寶生物科技有限責任公司
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              高血壓腦出血模型大鼠不同時間段腦損傷

              高血壓腦出血模型大鼠不同時間段腦損傷

              程度與 NO 含量和 C9 表達的關系

              ( 武漢市中南干休所醫務室,湖北 武漢 430071)

              摘要: 目的 研究高血壓腦出血模型大鼠不同時間段腦損傷程度與腦組織 NO 含量和 C9 表達的關系。方法采用膠原酶法制備腦出血動物模型,將 96 只大鼠隨機分為均等的 3 部分( 每部分 32 ) ,分別用于腦組織含水量測定、腦組織 NO 水平測定和 C9 表達檢測。每部分又隨機分為假手術組、模型組共 2 ,每組 16 ;每個小組 16 只大鼠再4個為一組,于造模后 2、12、24、72h 測各組大鼠腦組織含水量,腦組織 C9 表達,NO 含量。結果與假手術組比較,模型組 24 ~ 72h 腦組織含水量明顯增多、腦組織 C9 表達增多、NO 含量減少。結論腦出血急性期的腦組織損傷程度與腦組織 NO 水平、腦組織 C9 表達有一定關系,臨床**中改善腦循環、減輕炎癥反應非常重要。

              關鍵詞: 高血壓腦出血; NO; C9

              中圖分類號: 965. 1

              文獻標識碼: A

              文章編號: 2095-4646( 2014) 02-0103-03

              近年來的研究表明腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后血腫四周存在明顯的炎癥反應,炎癥反應在腦出血繼發性腦損傷中起著 十分重要的作用[1]。研究發現,補體系統在腦損傷炎癥反應過程中起著重要作用[2]。本實驗通過觀察不同時間段高血壓腦出血大鼠腦組織含水量、腦組織 C9 表達和 NO 水平,以探討其與腦損傷程度的關系。

              1 材料與方法

              1. 1 實驗材料

              1. 1. 1 動物分組與造模

              大鼠由湖北省動物實驗中心提供,合格證號:SCXK( 鄂) 2011 ~ 012; 分組: 將 96 只大鼠隨機分為均等的 3 部分( 每部分 32 ),分別用于腦組織含水量測定、腦組織 NO 水平測定和 C9 表達檢測。每部分又隨機分為假手術組、模型組共 2 組,每組 16; 每個小組 16 只大鼠再 4 個為一組,分別觀察術后 2h、12、24、72h 四個時間點各項指 標,各組飼養條件相同。

              高血壓模型及腦出血模型的制備是通過應用 雙腎雙夾法來復制腎性高血壓大鼠( HR)模型。 剔除飼養過程期間出現腦卒中癥狀和體征的大 。雙腎雙夾術后 2 ~ 3 月體質量300 ~ 350g / 的高血壓大鼠參照 osenberg[3 的方法,術前禁 食,可自由飲水,大鼠用****( 0. 1ml /100g) 注 射液腹腔麻醉后俯臥位固定于立體定位儀上,據圖譜調整立體定位儀于注射點,頭皮正中常規**后矢狀位切開約 1. 5cm,暴露前囟點,用骨鉆鉆顱打孔( 直徑約 1mm) 后 ,用微量進樣器吸取膠原酶 2μl 迅速插入鉆好的孔內,進針 5mm,注射時間不少于 15min,且留針 10min 后緩慢退針,鉆孔處用骨蠟封閉,局部**后,縫合皮膚。

              1. 1. 2 藥品與儀器注射用尿激酶( 03290,南京南大藥業有限責任公司) ,配制成 200IU /L 的溶液; 兔抗大鼠 C9 **組化試劑盒( 上海恒遠生化試劑有限公司) ; NO試劑盒來自南京建成生物工程研究所。儀器: 大鼠腦立體定位儀,微量注射儀購于北京智鼠多寶生物科技有限責任公司; 電子天平( SARTOR2US,BP211D) ,德國生產; 8021 離心機( 上海手術器械廠) ; 752 分光光度儀( 上海精密儀器儀表有限公司) ; 半自動**組化儀( 常州市郝思琳醫用儀器有限公司) ; 計算機病理圖像管理系統 4. 10( 北航圖像中心) 。

              1. 2 方法

              分別于術后第 2、12、24 72h,用 10% 水合氯醛麻醉大鼠后,迅速取出全腦,并用濾紙吸干腦表面液體和血跡,一部分置于中性福爾馬林內固定作 HE 染色和**組化染色。另一部分用于腦組織含水量測定。

              1. 2. 1 腦組織含水量測定[4

              將樣本小塑料封口袋密閉,置 20 ℃ 冰箱內5 ~ 10 min 微凍硬后取出,置于薄膜隔開的干冰上,用薄刀片切取離膠原酶注入點 4mm 以外的2mm 厚冠狀腦片,分離出血側皮質及基底節,置濃硫酸處理過的稱量杯內。用電子天平稱取濕重后,置小玻璃瓶中,再放入05℃ 烤箱內烘烤 24 ~ 48h,直到稱重為恒重。根據 Eliott 公式可以計算腦組織含水量( Water Content,WC) WC( % ) = ( 濕重 干重) ÷ 濕重 × 100%

              1. 2. 2 腦組織 C9 表達測定分別于第 2、12、24、72h 手術,取腦組織,固定: C9 著色于細胞漿和細胞膜。采用兔抗大鼠C9 **組化試劑合,按試劑盒要求檢測。在**組化陽性細胞胞漿及胞膜可見棕黃色顆粒。緊貼血腫周圍但不包括血腫區切片,每張切片隨機取4 個不重復高倍視野( 400 ) ,計數每個高倍視野 下陽性細胞數。所有切片均在同等強度下、同等 放大倍數下分析,取每一時間點高倍視野下的陽 性細胞數平均數,結果用 x珋± s 表示。

              1.2.3 NO 測定

              分別于第 2、12、24、72h 手術,微凍硬后取出,置薄膜隔開的干冰上,分離出血側皮質及基底節,4℃下用預冷的勻漿介質制備成 10% 的腦勻漿置 3000r /min 離心 15min 后,取腦勻漿上清液,按硝 基還原酶法測定 NO 的含量,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

              1.3 統計方法

              數據以 x珋± s 表示,SPSS 17. 0 統計分析。

              2

              2.1大鼠腦組織含量變化從表 1 可見,與假手術組相比,ICH 組腦組織含水量從 2h 開始增加,12h 增加較為明顯( P 0. 05) ,24 ~ 72h 增加*明顯( P 0. 01) 。

               

              2. 2 大鼠腦組織 C9 表達結果

              腦出血后 2h 血腫周圍可見少量 C9 表達,陽 性細胞為小膠質細胞( P 0. 05) ,腦出血后 12h 增加明顯,24h 達到高峰( P 0. 01) ,主要為小膠 質細胞和少量的神經元細胞,血管內皮細胞亦可 表達,一直持續到 72h。可見,腦出血后 24 ~ 72h, C9 的表達處于高峰,與假手術組比較有顯著性差 。見表 2。

               

              2. 3 大鼠腦組織中 NO 含量的結果 與假手術組比較,ICH 組大鼠 2h 腦組織 NO 含量已有下降,12h 已有顯著性差異( P 0. 05) , 24 ~ 72h 處于低水平( P 0. 01) 。

              3

              在腦出血的病理發展過程中,腦組織繼發性 損傷是腦出血病情加重、預后**的重要因素[5]。 出血性腦損傷的炎性反應,由白細胞粘附血管壁, -腦屏障遭破壞、炎性細胞侵入腦實質等組成。腦出血時炎性因子表達增加,能增加腦水腫、血管 壁通透性。NO 是由血管內皮細胞分泌的強有力 的血管舒張因子,可以直接作用于平滑肌細胞,通 過激活鳥苷酸環化酶,使細胞內的游離鈣水平降 低,平滑肌松弛。腦部血流是由內皮衍生的 NO 調節 的,NO 還是紅細胞聚集性的重要影響因 [6]。NO 可通過抑制白細胞-內皮細胞粘附、 止血小板凝集和疏通組織灌注等限制缺血性腦損 [7]。本實驗中與假手術組比較,ICH 組大鼠 2h 腦組織 NO 含量已有下降,12h 已有差異( P 0. 05) ,24 ~ 72h 處于較低水平( P 0. 01) ,說明腦出 血急性期 NO 下降是導致紅細胞聚集,進而溶解 破裂、血腫形成的重要因素,因而**中改善微循 環是重要環節。腦出血后腦水腫主要分為血管源 性腦水腫和細胞毒性腦水腫,血管源性腦水腫常 發生于腦出血早期,它的形成原因主要有血管壁 通透性增加、血管損傷、血漿外滲及血腦屏障破 [8]。腦出血后補體級聯被激活,C9 表達增加, 補體 C9-C5b 組成膜攻擊復合物( MAC) ,MAC 是大分子復合物,可形成跨膜孔道使大分子物質和 離子雙向流動,進而攻擊神經膠質細胞、神經細胞 和血腫內的紅細胞,加劇 ICH 后腦損傷,MAC 可直接插入星形膠質細胞、神經元和內皮細胞,破 壞血腦屏障。實驗表明腦出血后 24 ~ 72h,C9 表達處于高峰,說明在腦出血后腦水腫尤其在血 管源性腦水腫中補體系統對于其發展起著重要作用。

              京公網安備 11011502003119號

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